Inicialmente, cuando se declaró la Reserva de Pesca en el año 2004, ocupaba una superficie total de 202 km2, concretamente desde el caño Martín Ruiz (Sevilla) dirección sur hasta Sanlúcar de Barrameda (Cádiz); y toda la franja del litoral del Espacio Natural de Doñana dirección norte hasta el límite con el municipio de Matalascañas (Huelva). La Reserva se dividió en tres zonas (A, B y C), en las que se llevó a cabo una regulación específica adecuada a las características del medio físico y biológico de cada una de ellas. El establecimiento de esta zonificación se fundamentaba en la existencia de condiciones físico-químicas y biológicas diferenciadas según la proximidad a la desembocadura del río Guadalquivir, aspectos que los estudios realizados han refrendado.
Posteriormente, los diferentes estudios científicos llevados a cabo tanto en la Reserva como en las áreas de influencia de la misma, han puesto de manifiesto el papel esencial que juega el estuario como zona de alevinaje y cría para la mayoría de las especies que constituyen la comunidad acuática del Golfo de Cádiz. Adicionalmente, estos estudios también han determinado que las zonas de Reserva adyacentes al estuario, presentan una elevada abundancia de individuos de talla comercial de chirla y coquina, convirtiéndose estas zonas en un reservorio de reproductores, y por tanto, aportando una gran proporción de los ejemplares de coquinas y chirlas que posteriormente constituirán las poblaciones adultas que se capturarán en el resto del litoral.
En consecuencia, todos los estudios y observaciones directas realizadas en torno a la Reserva evidencian la necesidad de extender sus límites, para reducir los impactos producidos por determinadas modalidades de pesca profesional y para potenciar la afluencia de individuos adultos de las principales especies pesqueras al estuario con el objeto de desovar.
En este sentido, en el año 2010 se amplió la superficie total de la Reserva, y en concreto, se modificó la superficie de la zona A hasta hacerla coincidir con el caño de la Esparraguera, así como la incorporación de una nueva zona denominada D, en la zona de poniente, con el objeto de que contribuyera a una mejor y mayor protección de la reserva, de forma que actualmente la superficie total de la Reserva de Pesca de la Desembocadura del río Guadalquivir es de 402,06 km2.
El 6 de julio de 2022, se publica la Orden de 29 de junio de 2022, por la que se modifica la Orden de 16 de junio de 2004, por la que se declara una Reserva de Pesca en la desembocadura del río Guadalquivir, ampliando de nuevo la superficie de la Reserva, concretamente en el límite superior de la Zona A de la Reserva, coincidiendo con la Isla de Tarfía, cerca del caño que lleva su nombre.